树突状细胞(dendriticcells,DCs)在免疫应答的首要环节———抗原提呈中扮演着重要的角色,是目前公认的体内功能最强大的专职性抗原提呈细胞(antigen-presentingcell)。它能激活静息型T细胞,主要参与细胞免疫和T细胞依赖的体液免疫反应,在抗肿瘤免疫应答中起重要的作用。随着DCs的免疫治疗进入临床研究,足量、稳定产生有效的DCs是技术的关键。
在人外周血中,DCs占比非常少,使用CD14磁珠(CD14 MicroBeads kit)分选单核细胞,体外培养诱导可以获得大量DCs,也是目前应用最广的一种DC获取方式,那实验具体如何开展呢?
Mo-DCs实验操作步骤
一、人外周血PBMC获取:
(1)PBMC概念:是英文peripheral blood mononuclear cell的缩写,中文名叫外周血单个核细胞,是指外周血中具有单个核的细胞,包含淋巴细胞、单核细胞等。
(2)实验材料
用途 |
货号 |
产品名称 |
规格 |
将外周血处理成PBMC |
17144003 |
Ficoll Paque Plus |
6x500mL |
(3)操作步骤
(4)实验结果 :密度梯度离心之后从上到下依次是:血浆-PBMC-Ficoll-粒细胞-红细胞。
二、磁珠分选获得CD14单核细胞:
(1)磁珠分选原理:用MACS®超顺磁性微珠磁性标记细胞或生物分子,然后在高强度、梯度磁场中,通过MACS®分选柱分离出目的细胞。
(2)实验材料
用途 |
货号 |
产品名称 |
规格 |
分选套装 |
130-090-312 |
MinIMACS Starting Kit |
Kit |
分选用磁珠 |
130-050-201 |
CD14 MicroBeads, human |
2 mL |
Buffer缓冲液 |
130-091-221 |
6x1.5L |
注意:分选套装里面包含:1个MiniMACS Separation Unit(分选器);25个MS分选柱;1个MACS MultiStand。
(3)操作步骤
(4)实验结果:分选出的CD14+单核细胞的纯度为96.8±3.8%,得率为81.3±8.8%%,活性为97.5±1.4%。
三、Mo-DCs体外诱导分化:
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体外诱导分化实验检测结果
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四、Mo-DCs形态鉴定:
五、Mo-DCs功能鉴定:
(1)抗原递呈能力:
用FITC-labeled dextran评估单核细胞、imMo-DCs或 mMo-DCs的胞吞能力。用流式细胞仪检测平均荧光强度(MFI)。结果表明,imMo-DCs具有最高的抗原提呈能力。
(2)迁移能力检测:
mMo-DCs具有向CCL19迁移的能力,并呈现剂量依赖性。
(3)Mo-DCs诱导naive T细胞增殖的能力:
我们通过混合淋巴细胞反应实验(MLR),来评估Mo-DCs诱导naive T细胞的能力:先用Naive CD4 + T Cell Isolation Kit II从PBMCs分选出Naive CD4 + T细胞,再分别与Monocytes, imMo-DCs, mMo-DCs共培养7天,然后检测CD4 + T细胞的增殖情况,结果显示:mMo-DCs能够诱导T细胞增殖。
(4)检测Mo-DCs分泌IL-12的能力:
用CD40L刺激后,对mMo-DCs分泌的IL-12和IL-10进行定量分析。结果表明,在CD40L的刺激下,mMo-DCs分泌IL-12。
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